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喂~PCR和NGS这两种检测技术你了解吗?扒拉了一篇资料你来“已阅”下

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    [LV.7]常住居民III

    发表于 2018-7-26 18:05:18 | 显示全部楼层 |阅读模式




    经常看到大家在微信群或论坛问:

    “这个PCR是检测啥的,具体什么意思,能看出什么信息。”

    因为不懂所以沉默,嗯,我去扒拉资料了,下面这篇应该讲的挺全的了,分享给各位家人了解学习哈。


    分子诊断: qPCR、二代测序NGS和数字PCR如何选?


    分子诊断是将分子生物学技术应用于疾病诊断的医学分支学科,利用分子生物学技术研究人体内源性或外源性生物分子的存在、结构或表达调控变化,为疾病的预防、预测、诊断、治疗、预后和转归提供信息和决策依据。精准医疗的发展,将持续推动分子诊断的进步。

    目前常见核酸分子诊断技术涉及三个技术:荧光定量PCR技术(qPCR)、数字PCR(dPCR)和高通量测序技术(NGS)

    如何选择,我们作一下简要介绍。

    数字PCR技术是继一代普通PCR、二代荧光定量PCR之后的第三代PCR技术,下面这张图应该可以很直观的表达出这三代PCR技术的发展历程了。

    那先来了解下什么是PCR,PCR是聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)的缩写,是一种分子生物学技术,用于扩增特定的DNA片段。这种方法由凯利·穆利斯(Kary Mullis)于1983年开发,当时他是Cetus公司的雇员,也是1993年诺贝尔化学奖的获得者,它是复制DNA片段的一种简单,廉价和可靠的方法,被用于生物医学研究和相关的很多领域。

    奇迹家人@Chasin 本身也是从事科研工作的,在大家在微信群讨论到PCR相关问题时,他有分享过一些相关知识:

    “普通PCR是通过反复升降温来实现扩增,然后检测核酸的含量。荧光定量PCR(qPCR)是直接扩增过程中插入荧光物质,然后通过检测荧光来定量。”

    嗯,qPCR通过荧光染料或荧光特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程。每扩增一条DNA链,就有荧光染料分子结合到双链DNA上或有荧光分子从探针上释放,实现荧光信号的累积。由于荧光积累与PCR产物形成完全同步,可通过软件对荧光积累信息进行分析和计算,获得待测样品模板的初始浓度。但是,qPCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量,无法做到精准绝对定量。

    所以,数字PCR(dPCR)来了。它是一种核酸分子绝对定量技术,相较于qPCR,数字PCR让你能直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。数字PCR已经被广泛应用到医学、生物学等各个领域,如拷贝数变异、突变检测、复杂来源样品中低丰度核酸分子检测、NGS数据验证、miRNA等微小差异表达研究、单细胞基因表达分析等方面,在已知突变的癌症分子标志物的检测、传染病病原体检测、基因组三倍体分析和基因表达分析等领域展现了强大的优势。

    再说说NGS,NGS即高通量测序,又名下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS),也就是肺癌病友及家属们常提及的“二代测序”,是相对于以传统的桑格测序(Sanger Sequencing)为代表的第一代测序技术而得名,它对一代测序技术革命性的改变,可一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定。可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。

    在基因组水平上,NGS可进行从头测序而获得该物种的全长序列,为后续研究奠定基础;对已知参考序列的物种,进行全基因组重测序可检测新的突变位点,发现个体差异的分子基础。在转录组水平上,NGS可进行全转录组测序,开展可变剪接、基因表达差异、新非编码RNA分子发现等研究。NGS与染色质免疫共沉淀和甲基化DNA免疫共沉淀技术相结合,可检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。NGS功能强大,适合用于探索筛选新的生物标志物,但是实验操作较复杂,数据分析难度较大,检测周期长,成本较高。

    综上,三种检测技术的简单对比如下:



    从上表来看,数字PCR因为灵敏度高、绝对定量、适合于医院操作等优点,在肿瘤液体活检、无创产前筛查、感染性疾病早期诊断等临床检测应用方面具有显著优势。NGS在检测未知序列、未知突变、高通量多位点检测方面是更好的选择,是科研和独立实验室服务的好工具。qPCR适用于较常规的临床分子诊断项目。

    了解了这些基本知识后,家人们在讨论交流基因检测相关话题时其实就可以很顺畅了。

    “我只做了一个EGFR靶点的检测”、“医生开了单子,说在本院就能做基因检测”,这么说的一般都是在医院PCR实验室(其实就是病理科)做的检测,优点是费用便宜,但检测的靶点不全。

    “我是用外周血做的检测”、“医生给我推荐了一家公司,说能检测400多个基因”,这么说的一般都是在第三方基因检测公司做的检测,优点是检测的靶点全,一些新兴的预测标志物也能检测(比如TMB、MSI),但费用偏高。


    本文来源:丁香通

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